Родился (предположительно) в с. Мазепинцы близ Белой Церкви в семье шляхтича.
Учился в Киево-Могилянской академии, затем в иезуитском коллеже в Варшаве, а завершал образование в немецких университетах.
Служил при дворе польского короля Яна II Казимира, был послан на три года в Европу. Позднее ездил с поручениями от польского короля к украинским гетманам И. Е. Выговскому, Б. З. Хмельницкому, П. И. Тетере.
В 1669-1681 гг. служил у подчинявшегося Польше гетмана Правобережной Украины П. Д. Дорошенко, а затем у подчинявшегося России гетмана Левобережной Украины И. С. Самойловича.
В 1686 г. при поддержке князя В. В. Голицына участвовал в низложении гетмана Самойловича, дал присягу на верность России.
25 июля 1687 г. избран «царского величества Войска Запорожского обеих сторон Днепра гетманом».
В 1692—1695 гг. Мазепа разбил отряды гетмана Петрика (чьи претензии на гетманство поддерживал крымский хан).
В 1695—1696 гг. во время Азовских походов, действовал в низовьях Днепра в составе войска Б. П. Шереметева.
В 1697-1698 гг. вместе с русским войском ходил под Очаков.
В 1700-1721 гг. в ходе Северной войны обеспечивал содержание гарнизонов и фортификационные работы в крепостях Левобережной и Правобережной Украины, направлял отряды казаков на вспомогательные участки военных действий (к Пскову, на Волынь, в Галицию, в Белоруссию).
Мазепа неоднократно получал от русского правительства награды (в их числе орден Св. Андрея Первозванного, (1700, № 2) после А. Д. Меншикова), ему принадлежало свыше 100 тыс. крестьян на Украине и свыше 20 тыс. в России.
В 1703 г. за взятие г. Батурина (ныне — Черниговская область Украины) император Пётр I пожаловал ему земли в Курском крае (на территории современного Рыльского и Льговского районов Курской области, современного Ракитянского района Белгордской области и Путивльского района Сумской области Украины), которые Мазепа заселял беглыми людьми из правобережной Украины.
На Курской земле он основал села, которые назвал в честь своей фамилии, имени и отчества: Мазеповка, Ивановка, (ныне Ивановское), Степановка, и деревню Сучкино (в честь своей собаки), а также ряд деревень, Амонь, Коренево, Гапоновка, Студенок.
В 1704 г. в селе Ивановском Мазепа построил свою главную усадьбу (здание сохранилось). Рядовое казачество и крестьяне относились к Мазепе враждебно, в связи с чем последнему приходилось прибегать к политической и военной поддержке русского царя: гетманскую резиденцию в городе Батурине постоянно охранял стрелецкий (затем солдатский) полк.
Мазепа — один из крупнейших землевладельцев Украины, ему принадлежали более 100 тыс. крестьян на Украине и св. 20 тыс. крепостных в России. Стараясь показать свою «верность православию», жертвовал часть своих доходов на содержание и строительство церквей.
Несмотря на это, Мазепа проводил националистическую политику отделения Украины от России.
С этой целью, в первые годы Северной войны, он вел тайные переговоры с польским королем С. Лещинским, а затем с королем Швеции Карлом XII, обещая поднять восстание против России и присоединиться к шведам со своим казачьим войском.
По тайному соглашению Левобережная Украина, а также Курские и др. земли должны были отойти к Польше.
В 1708 г. Мазепа предал Петра I, открыто перейдя с небольшим числом сторонников (порядка 1500 человек казаков и старшин) на сторону шведского короля Карла XII.
В 1709 г. в Полтавской битве Карл XII и гетман Мазепа, потерпели поражение от русских войск. Мазепа бежал в турецкую крепость Бендеры, где вскоре умер.
Его курские земли и другое имущество конфискованы в пользу государевой казны, и затем пожалованы генералиссимусу князю А. Д. Меншикову.
Заочно был удостоен награды — "орден Иуды".
Ист.: Советская военная энциклопедия в 8-и томах. М., Воениздат 1976 – 1980. Т. 5 «Линия — Объектное», 1978